Генные мутации. Генные болезни. ДНК - диагностика. Методы и инструменты биотехнологии и генной терапии.

1. Под действием ультрафиолетового света двойные связи между атомами углерода в двух соседних остатках любого пиримидинового основания молекулы ДНК – тимина и цитозина – могут разорваться и произойдет соединение двух соседних пиримидиновых оснований друг с другом – образуется димер пиримидиновых оснований.

1. Какое максимальное число таких димеров может одновременно образоваться в следующей цепочке нуклеотидных остатков ДНК:

   5' АГТТЦГГТАЦЦАТЦТЦАГ 3'?

2. Соедините друг с другом нуклеотные остатки, образующие димер.

2. Ген эукариот представляет собой участок двух комплементарных и антипараллельных друг другу нуклеотидных последовательностей ДНК. Найдите мутацию, которую относят к ошибкам спаривания, в следующем фрагменте одного из генов:

3. Фрагмент исходной (материнской) молекулы ДНК содержит следующие пары нуклеотидов:

Представим, что в верхней смысловой цепи произошла мутация: замена четвертого нуклеотида Ц на А.

1. Напишите фрагмент двухцепочечной молекулы ДНК с измененной нуклеотидной последовательностью.
2. Напишите нуклеотидные последовательности во вновь синтезированных (дочерних) молекулах ДНК, образовавшихся после редупликации на мутантной молекуле ДНК.
3. Какие трипептиды будут кодироваться фрагментами этих дочерних ДНК?

4. Участок нормального гена имеет следующую последовательность нуклеотидов, кодирующую участок нормального белка:

       5' АТЦЦТААААТЦТГТААТАЦАГАТГГГЦ 3'

Представим, что произошла мутация и один из нуклеотидов третьего триплета заменился на другой нуклеотид, в результате чего образовался стоп-кодон. Какой нуклеотид был заменен и на какой при такой мутации?

5. Под действием ультрафиолетового света двойные связи между атомами углерода в двух соседних остатках любого пиримидинового основания молекулы ДНК – тимина и цитозина – могут разорваться и произойдет соединение двух соседних пиримидиновых оснований друг с другом – образуется димер пиримидиновых оснований.

Какое максимальное количество димеров тимина может одновременно образоваться в участке двухцепочечной молекулы ДНК, одна из нуклеотидных цепочек которого имеет следующую нуклеотидную последовательность:

      5' ГААЦТТГГАЦААТТГААТГ 3'?

6. В норме шестой триплет нуклеотидов ГАГ в гене, кодирующем бета-цепь гемоглобина, шифрует одну из аминокислот, имеющих важное значение для формирования четвертичной структуры гемоглобина. У больных, страдающих серповидноклеточной анемией, второй нуклеотид в этом триплете заменен на Т, что ведет к замене аминокислоты в молекуле бета-цепи гемоглобина. Это сопровождается полимеризацией гемоглобина и существенным изменением формы эритроцитов.

Какие аминокислоты находятся в шестом положение в нормальном и мутантном генах ?-цепи гемоглобина?

7. Фенилкетонурия – рецессивное генное заболевание, обусловленное мутацией в гене фенилаланингидроксилазы (РАН), в результате которой в РАН в 408-й позиции аргинин заменен на триптофан.

1. Какой триплет изменился в результате мутации?
2. В чем заключается изменение этого триплета?

8. Существуют мутации динамического типа, которые связаны с увеличением числа тринуклеотидных повторов в тех или иных участках молекулы ДНК. Количество повторов возрастает после каждого акта редупликации. При достижении критического уровня количества повторов мутация начинает проявляться в фенотипе в виде патологического признака. Причем, чем больше этих повторов, тем раньше развивается заболевание, тем выше его пенетрантность и тем меньше продолжительность жизни больных.

Синдром фригильной (ломкой) Х-хромосомы обусловлен доминантной мутацией динамического типа в гене FMR-1. Эта мутация связана с увеличением числа копий тринуклеотидного повтора ЦГГ, расположенного в 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) гена FMR-1. У здоровых детей и взрослых число копий триплетного повтора варьирует от 6 до 54, а у больных - от 200 до 1800.

Молекулярно-генетический анализ ДНК трех новорожденных показал, что у первого ребенка в 5'-НТО гена FMR-1 присутствует 350, у второго – 780, а у третьего – 42 ЦГГ-повтора.

1. Кто из детей будет здоров, а кто может заболеть?
2. Кто из детей заболеет в более раннем возрасте?

9. В последние годы был открыт принципиально новый тип мутаций, характерный для многих нейродегенеративных заболеваний. Они заключаются в увеличении числа следующих друг за другом тринуклеотидных повторов. Так, в норме первый экзон гена SCA1 человека содержит 12-37 тандемных повторов ЦАГ, а у больных, страдающих спиноцеребеллярной атаксией 1, число этих повторов достигает 39-80 и более. У больных белок атаксин 1 содержит большее по сравнению с нормой количество тандемно расположенных остатков одной из аминокислот. Назовите эту аминокислоту.

10.Для выявления в клетках человека вирусной РНК используют РНК- зонды – небольшие нуклеотидные последовательности РНК, которые комплементарны участку выявляемой вирусной РНК и соединены с радиоактивным или флюоресцирующим веществом, ферментом или веществом, с которым связывается меченное антитело.

1. Представим, что искомый участок вирусной РНК имеет следующую последовательность нуклеотидов: 5' АУАГГЦЦАУГГГ 3'. Какой должна быть последовательность нуклеотидов РНК-зонда, способного соединиться с этим участком вирусной РНК на всем его протяжении?
2. Представим, что РНК-зонд имеет последовательность нуклеотидов 5' ГУУУАГГУАЦГЦ 3'. С какой последовательностью нуклеотидов в вирусной РНК будет связываться этот РНК зонд на всем своем протяжении?

11. Молекулы ДНК содержат различные палиндромные последовательности. Каждый палиндром – это последовательность-перевертыш, идентичный в обеих цепях при ее прочтении в направлении от 5'-конца к 3'-концу. Среди нижеуказанных найдите палиндромные последовательности:

12. Молекулы ДНК содержат различные палиндромные последовательности. Каждый палиндром – это последовательность-перевертыш, идентичный в обеих цепях при ее прочтении в направлении от 5'-конца к 3'-концу. Рестриктаза HaeIII находит палиндром 5' ГГЦЦ 3'/3' ЦЦГГ 5' и расщепляет ДНК внутри палиндрома между Г и Ц, рестриктаза BamHI находит палиндром 5' ГГАТЦЦ 3'/3' ЦЦТАГГ 5' и расщепляет ДНК внутри палиндрома между Г и Г. Найдите вышеупомянутые палиндромы в следующем фрагменте ДНК:

Обозначьте месторасположение участков разрезания ДНК вышеуказанными рестриктазами.

13. Молекулы ДНК содержат различные палиндромные последовательности. Каждый палиндром – это последовательность-перевертыш, идентичный в обеих цепях при ее прочтении в направлении от 5'-конца к 3'-концу. Найдите одну палиндромную последовательность в следующем фрагменте ДНК:

Обозначьте палиндром контуром из пунктирных линий.

14. Серповидноклеточная анемия – генетическое заболевание, которое обусловлено заменой одного нуклеотида в кодоне, шифрующем шестую аминокислоту в бета-цепи молекулы гемоглобина. Мутация затрагивает участок ЦЦТГАГГ. Человек может быть или гетерозиготным, или гомозиготным по нормальному или патологическому аллелю. Установление генетического статуса обследованного человека основано на следующей особенности. Существует нуклеаза (рестриктаза), которая узнает ЦЦТГАГГ- последовательности и расщепляет молекулу ДНК в этих участках. Эта нуклеотидная последовательность изменена в мутантном гене, поэтому нуклеаза не расщепляет ДНК в этом участке.

У здоровых гомозигот при проведении диагностической процедуры нуклеаза расщепляет ДНК в трех местах на четыре фрагмента следующей длины: 256,201,181 и 88 тысяч пар нуклеотидов. У гомозигот по мутантному аллелю образуется всего три фрагмента длиной 382,256 и 88 тысяч пар нуклеотидов. Какой из этих трех фрагментов содержит мутантный участок гена?

15. У представителей одной из рас человека внутрипопуляционная изменчивость митохондриальной ДНК оказалась выше, чем у представителей другой расы. Какая из этих рас является более древней? Поясните свой ответ.

16. Прион – белок, обладающий следующими особенностями: его молекулы с измененной пространственной структурой при контакте с другими молекулами этого же белка изменяют их пространственную структуру, увеличивая тем самым количество молекул с измененной пространственной структурой. Эти молекулы собираются в большие агрегаты, накапливаются в клетках и вызывают такие заболевания как скрепи, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота и других животных, болезнь Крейтцфельдта-Якоба, куру и смертельная семейная бессонница.

Инфекционный прионный белок PrPSc устойчив к действию протеаз – ферментов, расцепляющих белки. Поэтому заражение животных и человека часто происходит при поедании тканей зараженных животных. Молекулярная масса белка PrPSc в результате гидролитического воздействия протеазы К снижается незначительно и сохраняется на уровне 27-30 кДа. Оставшаяся часть белка называется инфекционным прионным белком PrP27-30. Попав в клетки селезенки и головного мозга, этот белок изменяет укладку нормального белка PrPC и переводит его в патологическую форму PrPSc. Приняв, что молекулярный вес аминокислотного остатка в молекуле белка равен в среднем около 110 дальтон, определите примерное число аминокислотных остатков в молекуле инфекционного прионного белка PrP27-30.

17. Фермент Tag I узнает в молекуле ДНК палиндромную последовательность 5' ТЦГА 3'/ 3' АГЦТ 5' и разрезает ДНК между Т и Ц этой палиндромной последовательности с образованием липких концов.

Сколько фрагментов ДНК с липкими концами образуется после воздействия ферментом Tag I на молекулу ДНК, имеющую следующее строение:

Ломаной линией изобразите разрезаемые участки ДНК.

18. Если ДНК обработать определенной эндонуклеазой (рестриктазой), то этот фермент разрежет молекулу ДНК в строго определенных местах на большое число фрагментов разной длины. С помощью специальной процедуры эти фрагменты разделяют и окрашивают. Поскольку ДНК разных людей различаются по нуклеотидным последовательностям, то их ДНК будет разрезаться нуклеазой в разных местах и образующиеся фрагменты ДНК будут различны у разных людей.

Набор различающихся по длине фрагментов ДНК у конкретного человека отличается от подобного набора другого человека. Это позволяет по такому "ДНК-отпечатку" найти человека, которому принадлежит взятая для анализа ДНК. В этом заключается метод геномной дактилоскопии, который используют в судебной медицине.

В таблице представлены результаты анализа четырех образцов ДНК. Изучите эти результаты и определите того подозреваемого, на рубашке которого находится кровь пострадавшего.

Набор фрагментов ДНК из крови пострадавшего	Набор фрагментов ДНК из пятен крови на рубашках подозреваемых			Набор фрагментов ДНК известного размера
	подозреваемый    1	подозреваемый 2	подозреваемый 3
_______ _______ _______   ______         _______ _______	_______ _______   _______       ______     _______	_______ _______ _______   ______         _______ _______	_______ _______ _______   _______     _______     _______	_______ _______ _______ _______ _______ _______ _______ _______ _______ _______ _______ _______ _______ _______

 

19. Для выявления патологических аллелей, вызывающих некоторые генные наследственные заболевания, используют ДНК-зонды - однонитевые последовательности ДНК, которые комплементарны участку выявляемых патологических аллелей и соединены с радиоактивным или флюоресцирующим веществом, ферментом или веществом, с которым связывается меченое антитело.

1. Представим, что участок патологического аллеля больного человека имеет следующую последовательность нуклеотидов:

   5' ГЦЦАТГААТЦЦГ 3'.

   Какой должна быть последовательность нуклеотидов в ДНК-зонде, способного соединиться с этим участком патологического аллеля на всем его протяжении? Изобразите ДНК-зонд рядом с участком патологического аллеля.

2. ДНК-зонд имеет следующую последовательность нуклеотидов:

20. Обычно мутация гена ведет к изменению биохимического признака и формированию клинического фенотипа наследственной болезни. При этом синтезируется измененный белок или он вообще не синтезируется. Но иногда наблюдается частичная или полная нормализация фенотипа мутантного аллеля: мутантный аллель обеспечивает формирование нормального признака. Одним из примеров частичной нормализации синтеза белка является следующее явление.

При наследственном дефиците полноразмерного аполипопротеина В (апоВ100) – белкового компонента липопротеидных частиц плазмы крови – в мутантном гене происходит потеря нуклеотида Ц и формируется короткий тракт из восьми нуклеотидов А. Обычно на мутантном гене синтезируется укороченный белок апоВ100, но в 10% случаев РНК-полимераза считывает последовательности из однотипных нуклеотидов с ошибкой: она добавляет в синтезируемую иРНК еще один нуклеотид такого же типа. Такое явление называется феноменом " скольжения"или "спотыкания" фермента. В результате такой ошибки эта мутантная иРНК будет содержать 9 нуклеотидов А, что приведет к восстановлению рамки считывания и синтезу полноразмерного белка апоВ100, который будет отличаться от нормального лишь одной аминокислотой.

Изучите последовательности нуклеотидов в нормальных и мутантных генах и иРНК.

нормальный ген: 5' АГТТТГАААААЦАААГЦАГАТТАТ 3'

мутантный ген: 5' АГТТТГААААААААГЦАГАТТАТ 3'

мутантная иРНК с потерей нуклеотида: 5' АГУУУГААААААААГЦАГАУУАУ 3'

мутантная иРНК с потерей одного и вставкой другого нуклеотида: 5' АГУУУГАААААААААГЦАГАУУАУ 3'

Чем различаются полноразмерные белки, один из которых образовался на нормальной иРНК, а другой – на мутантной иРНК, образовавшейся со вставкой нуклеотида, восстанавливающей рамку считывания?

21. Генная инженерия занимается созданием новых генетических конструкций. Обязательными и незаменимыми инструментами этого сложнейшего процесса являются ферменты. Важнейшими из них являются рестрикцирующие эндонуклеазы – рестриктазы, которые узнают и осуществляют разрезание (рестрикцию) двухцепочечной молекулы ДНК в строго определенных местах – сайтах рестрикции. Например, рестриктаза EcoRI узнает нуклеотидную последовательность: 5' ГААТТЦ 3' /3' ЦТТААГ 5' и расщепляет молекулу ДНК в каждом участке, содержащем такую последовательность нуклеотидов. При этом разрезание осуществляется между Г и А в каждой нуклеотидной цепи сайта рестрикции. После разрезания молекулы ДНК получается несколько отдельных ее фрагментов, длина которых зависит от расстояния, на котором находятся соседние сайты рестрикции.

1. С помощью небольших вертикальных стрелок произвольно укажите на рисунке 3 места (сайта) разрезания (рестрикции), узнаваемые рестриктазой EcoRI. Пронумеруйте участки ДНК между обозначенными вами сайтами рестрикции.
2. Сколько рестрикционных фрагментов образуется после воздействия на ДНК рестриктазой EcoRI? Нарисуйте фрагменты ДНК, получившиеся после рестрикции (разрезания).
3. Как изменятся количество и длина рестрикционных фрагментов, если в одном из сайтов рестрикции молекулы ДНК изучаемого организма будет присутствовать мутация: А будет заменен на Т? Нарисуйте фрагменты мутантной ДНК, получившиеся после рестрикции.

22. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет многократно увеличить количество нужных нуклеотидных последовательностей из ничтожных количеств ДНК животного и растительного происхождения, включая ископаемые образцы.

Полимеразная цепная реакция представляет собой следующие друг за другом автоматизированные и управляемые циклы репликации ДНК, каждый из которых осуществляется в несколько этапов, идущих при разных температурах. При этом число молекул ДНК в каждом реакционном цикле удваивается.

1. Сколько молекул ДНК будет получено после 20-ти циклов репликации?
2. Сколько реакционных циклов репликации нужно осуществить для того, чтобы увеличить количество исходной ДНК в миллион раз?

23. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей. С помощью ПЦР получают, например, копии молекул ДНК. Синтез новых нуклеотидных цепочек осуществляет фермент ДНК-полимераза. Этот фермент начинает синтез новой нуклеотидной цепи только тогда, когда с нуклеотидной цепочкой исходной молекулы ДНК комплементарно связана небольшая нуклеотидная последовательность - праймер, или затравка. В естественных условиях клетка синтезирует РНК-праймеры, а при проведении ПЦР для синтеза молекул ДНК используют искусственно синтезированные ДНК-праймеры. ДНК-полимераза присоединяет к 3' – концу праймера первый нуклеотид ДНК, к первому нуклеотиду присоединяет второй, ко второму - третий и т. д.

При проведении ПЦР для получения многочисленных копий молекулы ДНК используют два синтетических ДНК-праймера. Один синтетический ДНК-праймер связывается с одной нуклеотидной цепью исходной молекулы ДНК, а другой ДНК-праймер - с другой нуклеотидной цепью молекулы ДНК.

Изобразим предварительно молекулу ДНК следующим образом:

Предположим, что начальный участок одной нуклеотидной цепи этой молекулы ДНК имеет вид: 5' ААГЦЦГТТАЦЦГААГ 3', а начальный участок второй нуклеотидной цепочки нуклеотидов имеет вид:

5' ТАТЦЦГГГГЦТАЦЦТ 3'.

Преобразуйте прежнее изображение исходной молекулы ДНК, поместив в соответствующие места вышеуказанные нуклеотидные последовательности. Затем рядом с началом каждой цепи расположите комплементарную последовательность из пяти нуклеотидов – ДНК-праймер, к которому фермент ДНК-полимераза будет присоединять нуклеотиды ДНК. Стрелками укажите то направление, в котором молекулы этого фермента будут перемещаться, синтезируя новые нуклеотидные цепи.

24. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет многократно увеличить количество нужных нуклеотидных последовательностей из ничтожных количеств ДНК животного и растительного происхождения, включая ископаемые образцы.

Полимеразная цепная реакция представляет собой следующие друг за другом автоматизированные и управляемые циклы репликации ДНК, каждый из которых осуществляется в несколько этапов, идущих при разных температурах. При этом число молекул ДНК в каждом реакционном цикле удваивается.

Для удлинения нуклеотидных цепей используют синтетические ДНК-праймеры, комплементарно связываюшиеся с участками нуклеотидных цепей молекулы ДНК.

Представим, что исходный образец ДНК имеет следующий вид:

и в наличии имеется праймер 5' ЦТТАГ3'.

Напишите нуклеотидные последовательности двухцепочечной молекулы ДНК, многочисленные копии которой будут преобладать в реакционной смеси после нескольких десятков реакционных циклов репликации.

25. Обычно время жизни белков составляет от нескольких минут до нескольких часов. Присоединение к N- концу белка таких аминокислот как серин, аланин, триптофан, валин и некоторых других, увеличивает время жизни белка. Аминокислоты, увеличивающие время жизни белков, можно включать в белки генноинженерными методами.

Представим, что участок значащей (смысловой) нуклеотидной цепи гена кодирует короткий пептид и имеет следующий вид:

5' ЦГТГТГТГЦТГГТТЦАААААГЦАГ 3' значащая цепь ДНК

NH₂ - арг-вал-цис-трп-фен-лиз-лиз-гли - СООН пептид

1. Напишите аминокислотную последовательность вышеуказанного пептида, к N-концу которого присоединена последовательность серин-аланин, увеличивающая время жизни этого пептида.
2. Какой вид имеет нуклеотидная последовательность, кодирующая модифицированный долгоживущий пептид?

26. Часто белковые продукты клонированных генов оказываются настолько чужеродными для хозяйской клетки, что они быстро разрушаются ее ферментами. Это затрудняет получение больших количеств белка, кодируемого введенным в хозяйскую клетку чужеродным геном. Одним из способов защиты этого белка от расщепления ферментами служит присоединение продукта клонированного гена к какому-либо стабильному белку клетки-хозяина. Конструкция из двух белков называется химерным белком; слияние белков программируется на уровне ДНК путем создания гена, кодирующего химерный белок.

Для последующего удаления хозяйского белка между кодирующими нуклеотидными последовательностями двух белков встраивают особую последовательность нуклеотидов, кодирующую следующую короткую аминокислотную последовательность: изолейцин-глутамат-глицин-аргинин. Эту аминокислотную последовательность узнает фактор свертывания крови Х_a , который расщепляет химерный белок на С-конце вышеуказанной последовательности. После этого функциональный белок, кодируемый клонированным геном, высвобождается и используется на следующих этапах биотехнологического процесса.

1. Напишите последовательность нуклеотидов ДНК, кодирующую цепочку из четырех аминокислотных остатков, узнаваемую фактором свертывания крови Х_а.
2. Какую нуклеотидную последовательность имеет та иРНК, на которой синтезируется эта аминокислотная последовательность?
3. Изучите аминокислотную последовательность участка химерного белка.

27. Рестриктазы – ферменты, которые узнают определенные короткие нуклеотидные последовательности ДНК и разрезают ее в строго определенном месте этих последовательностей. Образующиеся после разрезания фрагменты ДНК называются рестрикционными фрагментами, или рестриктами. Места узнавания и разрезания (рестрикции) строго специфичны для каждой рестриктазы. Рестриктазы бактерий являются средством защиты от проникающих в них вирусов. Рестриктазы служат важнейшими инструментами генетической инженерии. Используя комбинации разных рестриктаз и сравнивая размеры рестрикционных фрагмантов, можно построить так называемые рестрикционные карты, на которых указано положение каждого участка рестрикции относительно других рестрикционных участков.

Изучите рестрикционную карту одной молекулы ДНК. Вертикальными стрелками обозначены места рестрикции для рестриктаз A, B и С.

1. Сколько сайтов узнавания для каждой рестриктазы содержит изучаемый фрагмент молекулы ДНК?
2. Сколько рестриктов образуется при раздельном использовании каждой из вышеуказанных рестриктаз?
3. В каком случае образуется рестрикт наибольшей длины?
4. В каком случае образуется рестрикт наименьшей длины?
5. Сколько рестриктов образуется при использовании следующих комбинаций рестриктаз:

             а) А и В     б) А и С     в) В и С     г) А, В и С?

28. Одним из первых этапов выделения из смеси разных видов РНК (рибосомных, транспортных, информационных и других) той иРНК, которая кодирует интересующий ученых конкретный эукариотический белок, является отделение всех молекул иРНК от РНК других видов: рибосомных, транспортных и иных. Используют важнейшую особенность большинства иРНК эукариот: на своем 3'-конце они содержат поли (А) - последовательность. На неподвижной твердой основе закрепляют молекулы одноцепочечной ДНК-последовательности, комплементарной поли (А)-последовательности улавливаемых иРНК. Затем раствор со всеми РНК пропускают мимо этих закрепленных ДНК-последовательностей и они улавливают все молекулы иРНК, комплементарно связываясь с их поли (А) -"хвостами".

Напишите одноцепочечную ДНК-последовательность из 15-и нуклеотидных остатков, используемую для улавливания молекул иРНК.

Изобразите молекулу иРНК, поли (А) которой комплементарно связан с ДНК-последовательностью, закрепленной на вертикально расположенной твердой основе.

29. Аптамеры – это синтетические однонитевые цепочки из нескольких десятков нуклеотидов ДНК, специфически взаимодействующие с той любой наперед заданной мишенью, для которой они отобраны путем предварительной селекции. Аптамерные молекулы ДНК имеют высокоупорядоченную третичную структуру, которая позволяет им образовывать устойчивые и специфические комплексы с различными мишенями. В качестве мишени выступают белки, нуклеиновые кислоты, низкомолекулярные вещества и т.п.

Первоначально предполагалось использовать аптамеры в качестве терапевтического средства. В последние годы начата разработка биосенсоров, где в качестве рецепторов используются аптамерные ДНК. Один из таких биосенсоров разработан для измерения концентрации тромбина в крови. Этот фермент является ключевым в системе свертывания крови.

Одним из важных участков созданного аптамера является следующая последовательность из 15-ти нуклеотидных остатков: 5' ГГТТГГТГТГГТТГГ 3'. Какой вид имела та нуклеотидная последовательность, которая послужила матрицей для синтеза больших количеств вышеуказанного участка аптамерной ДНК?

30. Многие заболевания человека связаны с избыточной продукцией нормального белка. Для лечения таких состояний разрабатывают терапевтические системы с использованием “антисмысловых” РНК, которые присоединяются в клетке к молекулам иРНК , кодирующей нормальный белок, и тем самым снижают уровень трансляции этого белка .

Какая 3'—5'-последовательность нуклеотидов должна быть в “антисмысловой” РНК, чтобы она комплементарно присоединилась к участку иРНК, имеющему следующую последовательность нуклеотидов:

5' ГЦГАУУГГГЦГААААЦЦГ 3'?

31. В биотехнологии для упрощения очистки клонируемых белков используют химерные белки. Используемые для этой цели химерные белки включают в себя клонируемый белок (КБ) и присоединенный к нему маркерный пептид (МП) из 8 аминокислотных остатков. С помощью моноклональных антител к маркерному пептиду улавливают химерный белок и при необходимости с помощью ферментов отделяют маркерный пептид от клонируемого белка

Изобразите схему расположения следующих элементов искусственной генетической конструкции, обеспечивающей синтез химерного белка, содержащего ген человеческого интерлейкина-2:

а) ген человеческого интерлейкина-2(ген А)

б) промотор (П)

в) сегмент ДНК, кодирующий маркерный пептид (сегмент МП)

32. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) поражает один из видов лимфоцитов – Т-хелперы (Т_н-клетки), которые играют ключевую роль в иммунном ответе. На первом этапе ВИЧ-инфекции происходит взаимодействие между белком gp120 оболочки вируса и рецепторным белком CD4 на поверхности Т-хелперов. Пораженная клетка начинает производить вирусный белок gp120, который затем встраивается в наружную мембрану пораженной клетки.

Один из экспериментальных подходов в борьбе с ВИЧ-инфекцией заключается в следующем: создают систему для специфического узнавания и уничтожения ВИЧ-пораженных Т-хелперов. Узнает и уничтожает пораженные клетки химерный белок, который получают следующим образом. Сшивают два фрагмента ДНК, один из которых кодирует рецептор CD4, а другой – бактериальный экзотоксин А. Эти два фрагмента ДНК кодируют химерный белок. CD4-участок химерного белка соединяется только с белком gp120 пораженных лимфоцитов, а экзотоксин А-участок химерного белка обеспечивает его проникновение в пораженную клетку и инактивацию одного из белков, участвующих в трансляции. Это препятствует синтезу белка, что в конце концов приводит к гибели клетки, пораженной вирусом.

Химерный белок синтезируется клетками E.coli, в которые введена плазмида с генетической конструкцией, включающей в себя следующие элементы:

а) участок (CD4), кодирующий рецептор CD4

б) промотор (П) бактериофага Т7

в) участок (ЭА-II), кодирующий ту часть экзотоксина А, которая обеспечивает проникновение химерного белка в клетку

г) участок (Rb) связывания молекулы иРНК с рибосомой

д) участок (ЭА-III), кодирующий ту часть экзотоксина А, которая осуществляет инактивацию одного из белковых факторов трансляции

Расположите в правильной последовательности все выше перечисленные элементы генетической конструкции, обеспечивающей синтез химерного белка клетками E.coli.

33. Биологические чипы, или биочипы, представляют собой наиболее передовую технологию биомолекулярного анализа, в частности, анализа нуклеиновых кислот. На поверхности биочипа расположено от нескольких сотен до сотен тысяч ячеек размером от 10 до 150 мкм, в которых иммобилизованы разные молекулы олигонуклеотидов с известными ДНК-последовательностями. Они способны взаимодействовать с анализируемыми фрагментами нуклеиновых кислот путем спаривания комплементарных оснований. В каждой ячейке находится строго определенная известная нуклеотидная последовательность. Если в какой-либо ячейке имеет место специфическое взаимодействие нуклеиновых кислот - гибридизация, то это свидетельствует о присутствии в изучаемом образце (в ткани, клетке, растворе) нуклеотидной последовательности, комплементарной одноцепочечному олигонуклеотиду, закрепленному в этой ячейке биочипа. Благодаря гибридизации становится известной последовательность нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи изучаемого образца.

Представим, что нам необходимо узнать, какие из интересующих нас генов (А, В, С, D и Е) функционируют в конкретной клетке в определенный период ее жизни. Сконструированный нами биочип содержит наборы олигонуклеотидов, каждый из которых комплементарен молекуле иРНК, образующейся в ходе транскрипции на каком-либо интересующем нас гене. Известно, что изучаемые нами гены образуют молекулы иРНК со следующими специфическими фрагментами:

Ген А    5' ГГЦАААГГГЦЦГАУГАУЦУГААГЦЦГАГЦ 3'

Ген В    5' ААГГГЦЦГАУГАУЦУГААГЦЦГАААУЦГЦ 3'

Ген С    5' АУАГЦГГЦЦУГАУАЦУГААЦАГЦГЦГАГЦ 3'

Ген D    5' ГУЦААГАУЦГГЦЦГГАУАУГАУЦУГАГАГ 3'

Ген Е    5' ГГЦУАУАГГУГЦЦГАУГААУЦУГААГУЦЦ 3'.

Гибридизация была обнаружена только в той ячейке микрочипа, в которой находился олигонуклеотид со следующей последовательностью нуклеотидных остатков:

олигонуклеотид чипа    5' ЦУЦУЦАГАУЦАУАУЦЦГГЦЦГАУЦУУГАЦ 3'.

Какой ген функционирует в клетке в изучаемый период ее жизни?